海水叶绿素初级生产力测定及提取方法

海水浮游植物色素测定

萃取荧光法(叶绿素a)

方法原理

叶绿素a的丙酮萃取液受蓝光激发产生红色荧光,过滤一定体积海水所得的浮游植物用90%丙酮提取其色素,使用荧光计测定提取液酸化前后的荧光值,计算出海水中叶绿素a的浓度。

主要仪器设备

a)荧光计 :激发光波长450 nm,发射光波长685 nm;

b) 抽滤装置:包括滤器、支架、抽滤瓶和真空泵;

c)玻璃纤维滤膜:其截留效率相当于0.65μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜;

d) 冰箱。

试剂

体积分数为90%的丙酮、体积分数为10%的盐酸、碳酸镁溶液p(MgCO:)=10g/dm2。

测定步骤

荧光计校准校准频率

至少每半年一次。

标准叶绿素 a溶液(ρ=1 mg/dm3 )制备

过滤一定量的生长良好、处于指数生长前期的培养硅藻,用90%丙酮提取其叶绿素a,或者用90%丙酮溶解一定量的市售叶绿素a结晶,浓度大约为p=1 mg/dm'。

标准叶绿素a溶液浓度标定

使用分光光度计正确测定标准叶绿素a溶液的浓度。.

叶绿素a标准工作溶液配制

用上述标准叶绿素a溶液配制浓度不同的标准工作溶液,供各量程档校准用。

换算系数 Fs的测定

上述不同浓度的标准工作溶液,在不同量程档上进行酸化前后荧光值的测定。各量程档的换算系

采样过滤 .

采样后,应尽快过滤。过滤海水的体积视调查海区而定,富营养海区一般可过滤50 ~100 cm3 ;

中营养海区过滤200 cm°~500 cm3 ;寡营养海区可过滤500 cm°~1 000 cm”。过滤时抽气负压应小于50 kPa,。

滤膜保存

过滤后的滤膜应在1h内提取,若无条件提取测量,可将滤膜对折,用铝箔包好,存放于低温冰箱(-20C),保存期可为60 d或放人液氮中保存期可为一年。

提取

将载有浮游植物的滤膜放人加有10 cm8体积分数为90%丙酮的提取瓶内,盖紧,摇荡,立即放于低温(0C)冰箱内,提取12 h~24 h。

荧光测定.

测定步骤如下:

a) 取出样品放在室温、黑暗处约0.5 h,使样品温度与室温一致;

b)每批样品测定前后,以体积分数为90%丙酮作对比液,测出各量程档的空白荧光值Fo和Fo2;

c)将提取瓶内，上清液倒人测定池中,选择适当量程档,测定样品的荧光值R;

d) 加1滴体积分数为10%盐酸于测定池中,30 s后测定其荧光值R。;

e) 将结果记录于表。

分光光度法(包括叶绿素a.b和c)

方法原理

叶绿素a、b、c的丙酮萃取液在红光波段各有一吸收峰。一定体积海水中的浮游植物经滤膜滤出,用90%丙酮提取其叶绿素,应用分光光度计测定,根据三色分光光度法方程,计算海水中叶绿素a、b.c的浓度。

试剂

碳酸镁溶液:p( MgCO3)= 10 mg/dm' ;体积分数为90%的丙酮。

主要仪器设备

主要仪器设备有以下几种:

a)分光光度计:波长必须准确,波带宽度≤2nm,消光值可读到0.001;

b)抽滤装置:见5.2.1.2 b);

c)滤膜:截留 效率相当于0.65 μm孔径的聚碳酸酯核孔滤膜或玻璃纤维滤膜、纤维素酯微孔滤膜或其他滤膜;

d)贮样干燥器、研磨器、离心机.具塞离心管和冰箱。

测定步骤

采样过滤

采样后应尽快过滤。将滤膜置于滤器上,加5cm°碳酸镁溶液,接着过滤海水样,过滤时负压应小于50kPa。过滤海水体积视调查水域而定,近岸水取0.5dm'~2dm3,外海水取5dm*~10dm'。

保存

过滤后的样品应立即研磨提取。若条件不允许,可将滤膜对折两次,置于贮样干燥器内低温(<- 20C )黑暗保存,期限最长两个月。

研磨

将载有浮游植物的滤膜放人研磨器,加2cm2或3cm3体积分数为90%的丙酮，研磨,后将样品移入具塞离心管中,研磨器用体积分数为90%丙酮洗涤2次或3次,洗涤液一并倒人离心管中,但总体积不

能超过10 cm23

提取

将具塞离心管置于低温黑暗处提取30min。

离心

提取液于4000 r/min 条件下离心10 min,上清液倒人刻度试管中,并定容为10 cm°或15 cm”。

测定

将提取液注人光程为1 cm~10 cm的比色槽中，以体积分数为90%丙酮作空白对照,用分光光度计测定波长为750 nm、664 nm、647 nm、630 nm处的溶液消光值。测定结果记录于表。

消光值选择

作浊度校正的750 nm处消光值不超过每厘米光程0. 005,664 nm处消光值最好在0. 1~0.8之间。

高效液相色谱(HPLC)法

方法原理

浮游植物所含各种光合色素经提取后,在一定溶剂系统中,可经高效液相色谱柱进行分离,再由检测器检测并获得色谱图。根据与标准色素比较保留时间及色谱图可鉴别色素种类,根据色谱峰的面积可计算含量。

主要仪器设备

a) 高效液相色谱仪:包括溶剂流动相系统、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、计算机等;

b)抽滤装置、玻璃纤维滤膜、液氮罐、超声波粉碎器和离心机等。

试剂

丙酮、水、甲醇.乙腈和乙酸乙酯(均为色谱纯);醋酸铵;BHT(2,6-二叔丁基对甲酚)、角黄素。

测定步骤

采样过滤

采样后,应尽快过滤,视海水中浮游植物数量,过滤0.5 dm°~4 dm’海水(贫营养海区3 dm3 ~4 dm3 ,中等营养海区1 dm*~2 dm2 ,富营养海区0.5 dm°~1 dm' ),过滤时使用孔径为0.65 μm、直径为25mm的玻璃纤维滤膜，抽滤负压不超过50kPa,并注意避光。

保存

过滤后,如不能立即提取，滤膜应保存在液氮罐中。在放入液氮或超低温冷冻之前,冷冻保存(-20C)不能超过20h。滤膜可用预先标记好的铝箔包裹保存。

萃取

将滤膜从液氮中取出,解冻约1min,放人玻璃离心管中,加入3cm290%丙酮,再加入50mm'角黄素作内标准物(角黄素亦可预先加在提取溶剂丙酮中)。用体积分数为90%丙酮提取一张玻璃纤维滤膜作空白样。混合物用超声波粉碎(50 W, 30s),然后在0C条件下提取24 h。分析前将提取物混匀后离心去除细胞残屑,并用载有聚四氯乙烯滤膜(直径13mm,孔径0.2μm)的注射式滤器过滤。

高效液相色谱测定

HPLC系统准备

a)高压进样阀(带有 200 mm'样品环);

b) C-18保护柱(50 mmX4.6 mm);

c) 反相C-18色谱分析柱(250 mmX4.6 mm);

d) 紫外-可见吸收检测器(测定波长为436 nm和450 nm);

e)配有数据处理系统软件的计算机;

f) HPLC溶剂:

溶剂A:甲醇: 0.5 mol醋酸铵(80 : 20)，0.01%BHT;

溶剂B:乙腈:水(87.5: 12.5), 0.01%BHT;

溶剂C:乙酸乙酯。

以上溶剂均用色谱纯,使用前以0.45pum滤膜过滤。

操作步骤

a) 用溶剂A建立并平衡HPLC系统1 h,流量为1 cm2 /min;

b)根据所测样 品的浓度范围,每种色素准备至少5个浓度的工作标准液，并以该标准液校正

HPLC系统;

c)取每种工作标准液1000mm3,以300mm3蒸馏水稀释,混匀并平衡5min,润洗样品注射器两次,进样500mm2(样品环体积的2.5倍);

d)色素样品和空白样的准备及进样方法同标准液。注意进样时应避免有气泡,样品间的进样间隔应保持均匀。预先混有蒸馏水或其他溶剂的样品不能滞留在自动进样器中,以免疏水性的色素从溶液中析出;

e) 进样后通过梯度洗脱程序(见表2)对叶绿素和类胡萝卜素进行最佳分离,分析过程中通过氦气或在线脱气机对流动相溶液进行脱气;

f)根据比较色素样品与标准的色谱峰的保留时间来鉴定样品的色素种类,收集各洗脱峰可进一步进行分光确定;

g) 填写表。

以上三种方法以萃取荧光法优先